金 丹 李寶聚 石延霞 謝學(xué)文　《食用菌學(xué)報(bào)》 2009年第01期　　摘 要: 本文將從平菇(Pleurotus ostreatus)褐斑病中分離純化的240多個(gè)菌株中,選出使平菇褐斑病發(fā)病快且病情...

金 丹 李寶聚 石延霞 謝學(xué)文　《食用菌學(xué)報(bào)》 2009年第01期

　　摘 要: 本文將從平菇(Pleurotus ostreatus)褐斑病中分離純化的240多個(gè)菌株中,選出使平菇褐斑病發(fā)病快且病情嚴(yán)重的菌株P(guān)G1702,對(duì)其進(jìn)行致病性試驗(yàn),結(jié)果表明菌株P(guān)G1702為引起平菇細(xì)菌性褐斑病的病原菌;顯微形態(tài)的觀察和擴(kuò)增出的16S rDNA序列與GenBank比對(duì)結(jié)果表明菌株P(guān)G1702為托拉斯假單胞桿菌(Pseudomonas tolaasii Paine)。 

　　關(guān)鍵詞: 平菇;褐斑病;托拉斯假單胞桿菌 

　　 

　　我國(guó)作為食用菌生產(chǎn)大國(guó),總產(chǎn)量約占全世界的70%以上,而平菇是我國(guó)北方的重要栽培種類。最近幾年北方平菇種植地區(qū)平菇褐斑病大面積發(fā)生,此病一旦發(fā)生,傳播迅速,很難防治,造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。褐斑病已經(jīng)影響了菇農(nóng)的經(jīng)濟(jì)效益,因此加快對(duì)褐斑病的研究、探索有效的預(yù)防控制手段迫在眉睫。本研究將形態(tài)鑒定方法與分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合,對(duì)引起平菇褐斑病的病原菌進(jìn)行鑒定,旨在為進(jìn)一步研究該病害奠定基礎(chǔ)。 

　　 

　　1 材料與方法 

　　 

　　1.1 材料 

　　 

　　平菇褐斑病菌株: 2007年8月~2008年10月,從遼寧、山東以及北京周邊地區(qū)采集大量平菇褐斑病病樣,共分離純化了240多個(gè)菌株。 

　　平菇:品種是397,由中國(guó)農(nóng)科院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所張金霞老師提供菌種,本實(shí)驗(yàn)室栽培。 

　　1.2 培養(yǎng)基 

　　NA培養(yǎng)基:牛肉浸膏3g,蛋白胨10g,NaCl 5g,瓊脂18g,蒸餾水1000mL,pH7.0。 

　　KB培養(yǎng)基:蛋白胨20g,甘油10g,MgSO41.5g,K2HPO41.5g,瓊脂15g,蒸餾水1000mL,pH7.2。 

　　LB培養(yǎng)基:蛋白胨10 g,酵母膏5 g,NaCl 10 g,蒸餾水1 000 mL,pH 7.0。 

　　平菇培養(yǎng)料:棉籽殼86.8%,麥麩13%,生石灰0.2%,含水量58%。 

　　1.3 平菇栽培方法 

　　采用23 cm×35 cm的聚乙烯塑料袋,每袋裝料量1 kg。養(yǎng)菌期間,溫度、相對(duì)濕度控制在25 ℃、65 %左右,發(fā)菌天數(shù)約為25 d。出菇期溫度控制在12~17 ℃、空氣相對(duì)濕度控制在70%左右,給予散射光照,適當(dāng)通風(fēng),當(dāng)子實(shí)體直徑生長(zhǎng)到1~2 cm左右時(shí)開始接種試驗(yàn)。 

　　1.4 致病性測(cè)定 

　　將根據(jù)參考文獻(xiàn)[1]分離純化的菌株在NA平板上25 ℃培養(yǎng)72~96 h,將細(xì)菌刷下配置成3×108個(gè)/mL的懸浮液20 mL,待平菇子實(shí)體直徑為1~2 cm左右時(shí),用毛筆將1 mL菌懸液均勻涂抹在子實(shí)體上,針刺法接種[2],設(shè)置清水對(duì)照,3次重復(fù)。接種后保濕24 h[2],之后進(jìn)行常規(guī)管理,并開始觀察發(fā)病情況,選出使平菇褐斑病發(fā)病快且病情嚴(yán)重的菌株。 

　　1.5 病原菌微觀形態(tài)觀察[3] 

　　將致病性測(cè)定選出的菌株在NA培養(yǎng)基上培養(yǎng)24~48 h后,用亞甲藍(lán)染色,油鏡下觀察細(xì)菌的形態(tài)和大小。 

　　1.6 培養(yǎng)性狀及熒光性的觀察 

　　將致病性測(cè)定選出的菌株在KB培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h后觀察菌落形態(tài),在波長(zhǎng)254 nm紫外燈下觀察是否有熒光產(chǎn)生。 

　　1.7 16S rDNA 分子鑒定[4,5] 

　　1.7.1 CTAB法提取細(xì)菌DNA 

　　 

　　將菌株P(guān)G1702接種于液體LB培養(yǎng)基中,27 ℃振蕩培養(yǎng)過夜。取2.0 mL培養(yǎng)物15 000 g 離心10 min。沉淀物加入568 μL的TE緩沖液,反復(fù)吹打使之重新懸浮,加入30 μL 10%SDS和15 μL的蛋白酶K,混勻,37 ℃溫育1 h。然后加入100 μL 5 mol/L NaCl, 充分混勻,再加入80 μL CTAB/NaCl溶液,混勻后65 ℃溫育10 min,加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)混勻,15 000 g離心10 min,將上清轉(zhuǎn)入一只新管中,加入0.6~0.8倍體積的異丙醇,輕輕混合15 000 g離心10 min,使DNA沉淀下來,用1.0 mL的70%乙醇洗滌后,再離心棄上清液,在潔凈工作臺(tái)中稍加干燥,重溶于20 μL TE緩沖液(含RNaseA<25 ng/mL)中,準(zhǔn)備電泳檢測(cè)。 

　　1.7.2 PCR擴(kuò)增 

　　利用16S rDNA的通用擴(kuò)增引物[5]SF:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和SR:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

　　PCR反應(yīng)體系(50 μL)為:5 μL 10×TB 緩沖液(含2.5 mmol/L Mg2+),dNTP(1.0 mmol/L)5 μL, 正向和反向引物(10 μmol/L)各2.5 μL, 5 mmol/L Taq DNA聚合酶2.0 μL,模板5 μL。 

　　PCR反應(yīng)條件為:94 ℃ 預(yù)變性5 min,94 ℃變性 30 s,52 ℃退火 30 s,72 ℃延伸1 min,30 個(gè)循環(huán)。 

　　擴(kuò)增后取3 μL PCR 反應(yīng)產(chǎn)物在 2.0 %的瓊脂糖凝膠電泳30 min 后,置紫外透射儀下觀察 DNA特異性條帶。 

　　1.7.3 PCR產(chǎn)物測(cè)序 

　　PCR產(chǎn)物測(cè)序由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物所完成。 

　　 

　　2 結(jié)果與分析 

　　 

　　2.1 致病性測(cè)定結(jié)果 

　　致病性測(cè)定結(jié)果表明:菌株P(guān)G1702使平菇397褐斑病發(fā)病快且最嚴(yán)重。將菌株P(guān)G1702接種5袋平菇397的子實(shí)體,接種后密切觀察平菇397的生長(zhǎng)以及發(fā)病情況,發(fā)現(xiàn)接種后24 h左右平菇397發(fā)病,病情嚴(yán)重(見封三圖1),無論是病斑形狀還是發(fā)病部位都與平菇褐斑病自然發(fā)病的癥狀相同(見封三圖2),對(duì)照未發(fā)病(見封三圖3)。 

　　 

　　2.2 顯微形態(tài) 

　　菌株P(guān)G1702在蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)41 h后,用亞甲藍(lán)染色,油鏡下可觀察到細(xì)菌呈桿狀,大小約為0.5~0.9 μm×1.4~3.4 μm(圖4);革蘭氏染色陰性;一極或兩極具有一根或多根鞭毛。 

　　 

　　2.3 培養(yǎng)性狀 

　　菌株P(guān)G1702在NA培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h后,菌落乳白色、粘稠、稍隆起、表面光滑、呈圓形、邊緣整齊(圖5),上述特征與張學(xué)敏等[6]描述的托拉斯假單胞桿菌(P. tolaasii)培養(yǎng)形態(tài)基本一致。菌株P(guān)G1702在KB培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h后,在波長(zhǎng)254 nm紫外燈下有熒光產(chǎn)生。 

　　 

　　2.4.1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳 

　　使用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳,結(jié)果表明,基因組DNA中擴(kuò)增出的16S rDNA 核苷酸片斷與DL2 000 Marker 比較, 約在1 500 bp 處有一明亮的PCR 特征性條帶,其分子量大小與菌株16S rDNA的理論值基本相符(圖6),雙蒸水為PCR反應(yīng)模板進(jìn)行的對(duì)照(CK)則無條帶。 

　　 

　　2.4.2 DNA測(cè)序結(jié)果比對(duì) 

　　將供試菌株P(guān)G1702測(cè)得的16S rDNA序列與GenBank的核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì),與GenBank中的登錄號(hào)為AF320990.1、AF094750.1、AF255336.1的相似性均達(dá)到99%。因此,判斷菌株P(guān)G1702為托拉斯假單胞桿菌(P. tolaasii Paine)。 

　　 

　　3 結(jié)論與討論 

　　 

　　通過致病性測(cè)定將從平菇褐斑病中分離純化的240多個(gè)菌株中,篩選出使平菇褐斑病發(fā)病快且病情嚴(yán)重的菌株P(guān)G1702為引起平菇細(xì)菌性褐斑病的病原菌;顯微觀察結(jié)果菌株P(guān)G1702與托拉斯假單胞桿菌(P. tolaasii)形態(tài)基本相同,進(jìn)一步對(duì)該菌株進(jìn)行16S rDNA分子檢測(cè),擴(kuò)增出的序列登錄 GenBank比對(duì)后,與托拉斯假單胞桿菌(P. tolaasii)的相似性達(dá)到99%,因此確定該菌株為托拉斯假單胞桿菌。 

　　 

　　1915年,TOLAAS[7]首次報(bào)道了蘑菇細(xì)菌性褐斑病,隨后Paine將病原細(xì)菌鑒定為P. tolaasii; 

　　1999年,MURATA[8]對(duì)平菇褐斑病的致病菌托拉斯假單胞桿菌進(jìn)行了研究,描述了托拉斯假單胞桿菌不同環(huán)境條件下的微觀形態(tài)。本研究在國(guó)外已有研究的基礎(chǔ)上,借鑒其研究方法同時(shí)結(jié)合自身的試驗(yàn)條件對(duì)國(guó)內(nèi)采集的平菇褐斑病進(jìn)行了鑒定,明確其病原為托拉斯假單胞桿菌(P.tolaasii),這為篩選有效的防治藥劑、采取防治措施和抗病品種選育的研究提供了依據(jù)。 

　　 

　　參考文獻(xiàn): 

　　[1]BESSETTE AE, KERRIGAN RW, JORDAN DC. Yellow blotch of Pleurotus ostreatus[J]. Appl Environ Microbiol, 1985, 50(6):1535-1537. 

　　[2]GANDY DG. A technique for screening bacteria causing brown blotch of cultivated mushrooms[J]. Rep Glasshouse Crops Res Inst, 1968: 150-154. 

　　[3]方中達(dá).植病研究方法[M]. 北京:北京農(nóng)業(yè)出版社,1998:181-182. 

　　[4]劉雅琴, 任毓忠, 李國(guó)英, 等. 新疆棉花細(xì)菌性爛鈴病病原菌鑒定[J]. 植物病理學(xué)報(bào), 2008, 38(3):238-243. 

　　[5]STACKEBRANDT E, GOODFELLOW M. Nucleic acid techniques in bacterial systematics[M]. New York: John Wiley and Sons. 1991:115-175. 

　　[6]張學(xué)敏,楊集昆,譚 琦.食用菌病蟲害防治[M].北京:金盾出版社, 1996:154,158-159,163-164. 

　　[7]TOLAAS AG. A bacterial disease of cultivated mushroom[J]. Phytopathology, 1915, 5: 51-54. 

　　[8]MURATA H. Characteristics of stress response in a mushroom-pathogenic bacterium, Pseudomonas tolaasii, during the interaction with Pleurotus ostreatus and carbon/nitrogen starvation in vitro[J].Mycoscience, 1999,40 (1):81-85. 

　　 

　　Identification of a Bacterium Causing Brown 

　　Blotch Disease of Pleurotus ostreatus 

　　JIN Dan1,2,LI Baoju1*,SHI Yanxia1,XIE Xuewen1 

　　 

　　1Institute of Vegetables and Flowers, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China; 

　　2Institute of Plant Protection, Shenyang Agricultural University, Shenyang, Liaoning 110161, China 

　　 

　　Abstract:A bacterium, strain PG1702, identified from more than 240 strains isolated from Pleurotus ostreatus mushrooms collected at different locations in China, was shown to cause severe brown blotch disease of P. ostreatus. Morphological characterization and 16S rDNA sequence analysis confirmed that isolate PG1702 was Pseudomonas tolaasii. 

　　Key words:Pleurotus ostreatus;brown blotch disease;Pseudomonas tolaasii