豬流感(Swineinfluenza!SI)是由豬流感病毒(SIV)引起的一種急性高度接觸傳染性的群發(fā)性呼吸道疾病!其特征為突發(fā)咳嗽#呼吸困難#發(fā)熱#衰竭及迅速康復(fù)!豬不分年齡#品種和性別均能感染!是規(guī)?；i場普遍存在難以根治的群發(fā)性疾病之一$ 1病毒特性豬流感病毒屬于正粘病毒科(0rthomyxoviridae)!甲型流感病毒屬(Influenza virus A)!典型病毒粒子呈球狀!直徑為 80 nm~120nm$病毒存在于病豬或帶毒豬的鼻液或氣管%支氣管滲出液以及肺和肺淋巴結(jié)內(nèi)!在雞胚尿囊腔#羊膜腔中及 MDCK#Vero細(xì)胞系均能良好增殖&研究表明!豬流感在雞胚增殖的敏感性遠(yuǎn)大于MDCK細(xì)胞!差異極顯著!故常用雞胚接種進(jìn)行病毒分離&同時(shí)!MDCK與Vero細(xì)胞系比較!MDCK細(xì)胞的敏感性大于Vero細(xì)胞!病毒增殖也較快!這為流感病毒在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系培養(yǎng)生產(chǎn)疫苗創(chuàng)造了條件[1!2&] 2豬流感的基因組結(jié)構(gòu)豬流感病毒屬單股負(fù)鏈RNA病毒!基因組約為13.6 kb! 由大小不等的8個(gè)獨(dú)立片段組成&8個(gè)基因片段編碼10個(gè)基因產(chǎn)物!其中片段1!3分別編碼PB2%PB1和PB3聚合酶!片段4和片段6分別編碼血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)!片段5 編碼核蛋白(NP)!片段7編碼病毒基質(zhì)蛋白Ml和離子通道蛋白M2!片段8編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NSl!NS2&8個(gè)基因片段的3’末端和5’末端都有保守的核苷酸序列!5’末端13個(gè)核苷酸序列是3’-GGAACAAAGAUGAppp-5’!3’末端的12個(gè)核苷酸序列是3’-OH-UCGU(C)UUUCGUCC-5’!這些序列的內(nèi)部互補(bǔ)性對體內(nèi)體外的最佳轉(zhuǎn)錄是至關(guān)重要的&另外這些末端序列也是激活流感病毒多聚酶活性!切下宿主成熟mRNA帽子結(jié)構(gòu)形成病毒前體mRNA上所必需& 3豬流感基因編碼蛋白 HA蛋白是病毒主要的糖蛋白!也是流感病毒主要的表面抗原!能夠結(jié)合細(xì)胞表面受體!利于病毒穿膜!并能誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生!產(chǎn)生免疫保護(hù)作用&HA分子量為75 Ku!約由562~566個(gè)氨基酸殘基組成&這些殘基包含信號(hào)肽%HAl和HA2部分!HAl和HA2兩部分之間由一個(gè)精氨酸連接&HA產(chǎn)生后到其發(fā)揮作用時(shí)!還經(jīng)過幾個(gè)切割加工過程!包括N端信號(hào)肽的切除及HAl和HA2的產(chǎn)生!這是病毒進(jìn)入細(xì)胞體內(nèi)進(jìn)行復(fù)制的前提&信號(hào)肽識(shí)別內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜!HA合成后信號(hào)肽就被切除!同時(shí)!HA也被切割成HAl和HA2&切割時(shí)去掉一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基!這與宿主細(xì)胞及毒株的毒力有關(guān)&HA單體由呈球狀的頭部和柄兩部分構(gòu)成!以三聚體的形式鑲嵌在雙層類脂膜上& NA是構(gòu)成病毒囊膜纖突的另一個(gè)重要蛋白成分!呈啞鈴狀!以四聚體形式存在&NA由453個(gè)氨基酸組成!作用是水解細(xì)胞表面的特異性糖蛋白末端的N"乙?；窠?jīng)氨酸!避免病毒粒子的聚集!利于病毒釋放!對病毒在感染細(xì)胞周圍的擴(kuò)散能力有很大影響&它的一級(jí)結(jié)構(gòu)包括氨基端胞漿尾%非極性跨膜區(qū)%莖部和頭部共4個(gè)結(jié)構(gòu)域&NA 酶活性的催化中心位于頭部頂端!呈凹陷狀!每個(gè)NA單體都有一個(gè)!所以NA纖突具有4個(gè)催化中心& 3.3核蛋白(NP)NP是一種單體磷酸化的多肽!是構(gòu)成病毒核衣殼的主要成分&NP分子量約60 Ku!約有500個(gè)氨基酸! 具體特異性!是流感病毒診斷最具代表性的蛋白&倪建強(qiáng)等3[] 利用含組氨酸標(biāo)簽的pET30原核表達(dá)系統(tǒng)!表達(dá)純化出NP 蛋白作為診斷抗原!其特異性高&NP至少有3個(gè)互相重疊的抗原區(qū)!其中一個(gè)區(qū)在各株流感病毒間均存在!針對這一區(qū)的單克隆抗體可抑制病毒RNA的轉(zhuǎn)錄&??????(Polymerase)由PB1% PB2和PB3組成!其分子量分別為96 Ku%87 Ku和85 Ku3個(gè)聚合酶與NP蛋白和病毒RNA相連接!構(gòu)成病毒特異性的聚合酶蛋白復(fù)合體!具有轉(zhuǎn)錄和核酸內(nèi)切酶的活性&它們的氨基酸序列上都含有一特異的親核序列區(qū)!以便使這3種蛋白質(zhì)在胞漿合成后能順利進(jìn)入細(xì)胞核&PB1的功能是在病毒 mRNA合成開始后催化新合成的延伸反應(yīng)(PB2的功能是識(shí)別并切割宿主細(xì)胞的mRNA帽狀結(jié)構(gòu)以產(chǎn)生用于病毒RNA 轉(zhuǎn)錄的引物"PB3在病毒RNA合成過程中的作用尚不清楚! 可能是一種蛋白激酶或解旋蛋白M1和M2屬于非糖基化蛋白! 富含精氨酸!分別由252個(gè)和97個(gè)氨基酸組成"M1是維持病毒形態(tài)的結(jié)構(gòu)蛋白!具特異性!其抗原性的差異也是流感病毒分型依據(jù)之一"M2是一種跨膜蛋白!以四聚體形式存在于感染細(xì)胞的細(xì)胞膜上!起質(zhì)子通道作用!能使M1膜打開!病毒 RNP進(jìn)入胞漿"  (Nonstructural Protei ns!NS)!NSl與NS2相互間有70個(gè)氨基酸重疊!分別由不同的 mRNA翻譯"NSl在細(xì)胞核內(nèi)合成并積聚!NS2主要在胞漿中! 它們分別在早期感染和晚期感染存在"NS蛋白的N末端含一個(gè)典型的細(xì)胞核定位信號(hào)(NES)!被認(rèn)為在病毒vRNP向細(xì)胞核外轉(zhuǎn)運(yùn)的過程中發(fā)揮作用"Neumann等4[]!發(fā)現(xiàn)當(dāng)細(xì)胞感染了缺少NS2蛋白的病毒或病毒NS2位點(diǎn)發(fā)生改變時(shí)!vRNP 復(fù)合體滯留在細(xì)胞核內(nèi)不能向胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)" 4豬流感病毒的變異誘發(fā)豬流感病毒發(fā)生變異的主要機(jī)理有$%1&抗原漂移 (antigenic drift)$基因組自發(fā)的點(diǎn)突變引起小幅度的變異!積累到一定程度或正好使抗原決定簇發(fā)生改變"%2&抗原轉(zhuǎn)變 (genetic shift)$兩種不同亞型病毒感染同一宿主細(xì)胞!兩者的基因片段發(fā)生遺傳重組"%3&RNA重組(RNArecombination)"%4& 缺損性病毒顆粒的產(chǎn)生" 在單克隆抗體和自然免疫應(yīng)答的選擇壓力下!SlV各節(jié)段發(fā)生了不同程度的遺傳進(jìn)化"1930年分離的第一株豬流感病毒HA基因漂移發(fā)生率估計(jì)在每年0.4%!0.48%[5]"M1#M2基因的變異率相對較慢!M2基因變異較M1快!將 A/Sw/Quebec/5393/91與A/Sw/Quebec/192/81流感株比較發(fā)現(xiàn)!M1蛋白的變異率約為0.08"!M2蛋白的變異率約為 0.51%6[]"豬流感病毒H1N1的NP基因以每年3.41個(gè)核苷酸發(fā)生改變!對應(yīng)的是每年0.34個(gè)氨基酸發(fā)生改變7[]" 豬上皮細(xì)胞表面同時(shí)存在唾液酸-a-2!6半乳糖苷 (SAa-2!6-Gal)和SAa-2!3-Gal受體位點(diǎn)!因此豬能夠同時(shí)感染人流感病毒和禽流感病毒"當(dāng)2個(gè)或2個(gè)以上流感病毒同時(shí)感染一個(gè)豬體細(xì)胞時(shí)!在增殖過程中不同病毒的基因組片段可以隨機(jī)重新組合!產(chǎn)生新的流感病毒亞型8[]"Karasin等9[] 系統(tǒng)分析印地安那州H1N2亞型發(fā)現(xiàn)是由古典H1型和美國 1998年出現(xiàn)的H3N2基因重組的結(jié)果"Webby等[10]發(fā)現(xiàn)美國分離株H1N2是由H1N1的HA基因和H3N2的另外7個(gè)基因重組的結(jié)果"同時(shí)發(fā)現(xiàn)!不含HA基因的H1N2與H3N2的相似程度高于Karasin報(bào)道的H1N2!這也說明各個(gè)H1N2重組株有其獨(dú)立的重組過程"Marozin等1[1]比較歐洲的H1N1# H1N2和H3N2型SIV發(fā)現(xiàn)!各個(gè)基因型間發(fā)生了基因交換" 同時(shí)發(fā)現(xiàn)1999年法國分離豬源H3N2在抗原性上與 A/Sydney/5/19相關(guān)性很高!這揭示了豬與人的的病毒之間發(fā)生了抗原轉(zhuǎn)變" 國內(nèi)從山東豬分離出H9N2流感病毒!分析可能是由雞和鴨流感病毒重組的結(jié)果1[2]"繼H9N2亞型流感病毒1998年首次從豬群中分離到!李海燕等[13]部分序列分析發(fā)現(xiàn)豬源 H9N2亞型與國內(nèi)分離的禽流感病毒高度同源!從血清學(xué)和病毒學(xué)證明了H9N2亞型病毒在我國豬群中存在" 5豬流感病毒的疫苗研制當(dāng)前!豬流感病毒疫苗的使用主要還是滅活疫苗!隨著分子生物學(xué)的發(fā)展!促進(jìn)了基因工程和蛋白質(zhì)工程技術(shù)的建立! 運(yùn)用此類技術(shù)對疫苗進(jìn)行了多方面的研究" 豬流感病毒活載體疫苗是將表面抗原HA和#或NA基因克隆到病毒活載體上!表達(dá)融合蛋白用于免疫"HA蛋白因其良好的免疫原性使其成為基因工程疫苗的首選!HA誘導(dǎo)產(chǎn)生的體液免疫應(yīng)答和中和抗體所提供的有效保護(hù)力大于NA"Tang等1[4]將豬H3N2型流感 HA基因克隆進(jìn)腺病毒構(gòu)建重組體疫苗(rAd-HA)!接種小鼠后能夠部分保護(hù)人流感病毒A/HK/1/68(H3N2)的攻擊"Ronald等1[5] 構(gòu)建了表達(dá)豬H3N2型流感HA基因腺病毒重組體!將其接種三周齡仔豬!四周后!接種HA重組體的豬產(chǎn)生高水平的血凝抗體"在其它病毒載體的探索上!國內(nèi)成功地在桿狀病毒系統(tǒng)中表達(dá)了SIVA/Swine/HeNan/703/2001(H3N2)NA基因!Western $%&’和神經(jīng)氨酸酶活性檢測結(jié)果顯示!表達(dá)產(chǎn)物具有良好的免疫原性和神經(jīng)氨酸酶活性1[6]"同時(shí)H3亞型豬流感病毒HA基因重組偽狂犬病毒載體也獲得成功[17]" 近年來!國外學(xué)者嘗試將M2蛋白(M2e)作為免疫原研制疫苗"2002年!heinen等1[8]構(gòu)建了表達(dá)M2e的DNA疫苗!產(chǎn)生的抗體不能中和病毒!感染H1N1后!不能對豬提供保護(hù)力! 同時(shí)促進(jìn)豬出現(xiàn)嚴(yán)重的臨床癥狀"這與heinen等1[92]001年提出的M2e產(chǎn)生抗體的增強(qiáng)作用利于機(jī)體保護(hù)的觀點(diǎn)不一致" 豬感染病毒后!細(xì)胞膜表面表達(dá)M2e!接合M2的抗體通過細(xì)胞尋靶促進(jìn)感染細(xì)胞死亡!但由于產(chǎn)生抗體不具病毒中和能力!當(dāng)病毒感染量太高!就不能對機(jī)體提供有效保護(hù)"事實(shí)表明!將M2蛋白作為免疫抗原還需要進(jìn)一步探討" 與滅活疫苗相比!流感減毒活疫苗對流感能夠提供更持久的保護(hù)!同時(shí)!活疫苗能夠誘導(dǎo)局部和全身性的綜合性抗體以及CMI(細(xì)胞免疫)"近年來!反向遺傳學(xué)開始應(yīng)用于流感病毒的研制!反向遺傳操作技術(shù)是指通過構(gòu)建RNA病毒的感染性分子克隆!在病毒cDNA分子水平上對其進(jìn)行體外人工操作"該技術(shù)在人流感弱毒疫苗的開發(fā)獲得成功!1999年!Fodor等2[0]首次通過12質(zhì)粒系統(tǒng)拯救出流感病毒!其中8個(gè)含人源pol I啟動(dòng)子和丁型肝炎病毒核酶序列調(diào)控的轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒(transcription plasmid)分別克隆出8條流感vRNA!另4個(gè)表達(dá)質(zhì)粒pGT表達(dá)出PBl!PB2!PA和NP 蛋白’2000年Hoffman等[21]在此基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)!通過8個(gè)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染!成功地拯救出流感病毒!主要方法是構(gòu)建含有pol I-poi II雙啟動(dòng)子的質(zhì)粒載體!在pol I啟動(dòng)子與終止子間插入 pol II啟動(dòng)子0和多聚腺苷酸!再將病毒基因插入該系統(tǒng)!利用細(xì)胞酶系統(tǒng)拯救出流感病毒’也有報(bào)道構(gòu)建出流感病毒弱毒苗!其中HA和NA基因來自H5N1!其余基因來自H1N1" 質(zhì)粒系統(tǒng)拯救流感病毒的成功!表明可以在拯救株上引入多個(gè)變異位點(diǎn)!減弱毒株活性!研制出安生性更好的弱毒疫苗" 迄今為止!國內(nèi)外均沒有成功拯救出SIV的報(bào)道!但該技術(shù)對人流感病毒的成功拯救!表明反向遺傳技術(shù)是豬流感弱毒疫苗研制的方向"但是!反向遺傳技術(shù)研制弱毒苗仍然存在基因突變的可能性!因而在通向制備弱毒苗的道路上仍有很多問題亟待解決! 研究人員嘗試將NP蛋白作為流感基因工程疫苗的添加成份來加強(qiáng)免疫"Ronald等1[5]構(gòu)建的表達(dá)NP蛋白的腺病毒重組體能減少SIV的復(fù)制"同時(shí)促進(jìn)流感病毒的消除!heinen等[18]構(gòu)建表達(dá)M2#NP蛋白的疫苗能產(chǎn)生針對NP蛋白的淋巴組織增生"并且機(jī)體產(chǎn)生體液免疫的同時(shí)有細(xì)胞免疫!這可能由于NP蛋白上存在保守的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)表位和交叉保護(hù)抗原表位"能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生非特異性的細(xì)胞免疫!Larsen等2[2]把含有白介素6 (interleuki n-6)作為佐劑的HA DNA疫苗免疫豬"發(fā)現(xiàn)能夠刺激體液免疫的產(chǎn)生"但不能顯著地增強(qiáng)豬的免疫反應(yīng)! Haneberg等2[3]在流感病毒滅活疫苗中混入霍亂毒素或一種細(xì)菌微粒可促進(jìn)淋巴組織介導(dǎo)的免疫反應(yīng)"提高疫苗對機(jī)體的保護(hù)力!Hilgers等2[4]利用磺豬流感病毒分子生物學(xué)研究進(jìn)展吳華!郭萬柱* (四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物生物技術(shù)中心!四川雅安625014) 中圖分類號(hào)"S852.65+9.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼"A文章編號(hào)"1008-0589(2006)02-0238-03 豬流感(Swine influenza!SI)是由豬流感病毒(SIV)引起的一種急性高度接觸傳染性的群發(fā)性呼吸道疾病!其特征為突發(fā)咳嗽#呼吸困難#發(fā)熱#衰竭及迅速康復(fù)!豬不分年齡#品種和性別均能感染!是規(guī)?；i場普遍存在難以根治的群發(fā)性疾病之一$ 1病毒特性豬流感病毒屬于正粘病毒科(0rthomyxoviridae)!甲型流感病毒屬(Influenza virus A)!典型病毒粒子呈球狀!直徑為 80 nm~120nm$病毒存在于病豬或帶毒豬的鼻液或氣管%支氣管滲出液以及肺和肺淋巴結(jié)內(nèi)!在雞胚尿囊腔#羊膜腔中及 MDCK#Vero細(xì)胞系均能良好增殖&研究表明!豬流感在雞胚增殖的敏感性遠(yuǎn)大于MDCK細(xì)胞!差異極顯著!故常用雞胚接種進(jìn)行病毒分離&同時(shí)!MDCK與Vero細(xì)胞系比較!MDCK細(xì)胞的敏感性大于Vero細(xì)胞!病毒增殖也較快!這為流感病毒在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系培養(yǎng)生產(chǎn)疫苗創(chuàng)造了條件[1!2&] 2豬流感的基因組結(jié)構(gòu)豬流感病毒屬單股負(fù)鏈RNA病毒!基因組約為13.6 kb! 由大小不等的8個(gè)獨(dú)立片段組成&8個(gè)基因片段編碼10個(gè)基因產(chǎn)物!其中片段1!3分別編碼PB2%PB1和PB3聚合酶!片段4和片段6分別編碼血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)!片段5 編碼核蛋白(NP)!片段7編碼病毒基質(zhì)蛋白Ml和離子通道蛋白M2!片段8編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NSl!NS2&8個(gè)基因片段的3’末端和5’末端都有保守的核苷酸序列!5’末端13個(gè)核苷酸序列是3’-GGAACAAAGAUGAppp-5’!3’末端的12個(gè)核苷酸序列是3’-OH-UCGU(C)UUUCGUCC-5’!這些序列的內(nèi)部互補(bǔ)性對體內(nèi)體外的最佳轉(zhuǎn)錄是至關(guān)重要的&另外這些末端序列也是激活流感病毒多聚酶活性!切下宿主成熟mRNA帽子結(jié)構(gòu)形成病毒前體mRNA上所必需& 3豬流感基因編碼蛋白 HA蛋白是病毒主要的糖蛋白!也是流感病毒主要的表面抗原!能夠結(jié)合細(xì)胞表面受體!利于病毒穿膜!并能誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生!產(chǎn)生免疫保護(hù)作用&HA分子量為75 Ku!約由562~566個(gè)氨基酸殘基組成&這些殘基包含信號(hào)肽%HAl和HA2部分!HAl和HA2兩部分之間由一個(gè)精氨酸連接&HA產(chǎn)生后到其發(fā)揮作用時(shí)!還經(jīng)過幾個(gè)切割加工過程!包括N端信號(hào)肽的切除及HAl和HA2的產(chǎn)生!這是病毒進(jìn)入細(xì)胞體內(nèi)進(jìn)行復(fù)制的前提&信號(hào)肽識(shí)別內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜!HA合成后信號(hào)肽就被切除!同時(shí)!HA也被切割成HAl和HA2&切割時(shí)去掉一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基!這與宿主細(xì)胞及毒株的毒力有關(guān)&HA單體由呈球狀的頭部和柄兩部分構(gòu)成!以三聚體的形式鑲嵌在雙層類脂膜上& NA是構(gòu)成病毒囊膜纖突的另一個(gè)重要蛋白成分!呈啞鈴狀!以四聚體形式存在&NA由453個(gè)氨基酸組成!作用是水解細(xì)胞表面的特異性糖蛋白末端的N"乙?；窠?jīng)氨酸!避免病毒粒子的聚集!利于病毒釋放!對病毒在感染細(xì)胞周圍的擴(kuò)散能力有很大影響&它的一級(jí)結(jié)構(gòu)包括氨基端胞漿尾%非極性跨膜區(qū)%莖部和頭部共4個(gè)結(jié)構(gòu)域&NA 酶活性的催化中心位于頭部頂端!呈凹陷狀!每個(gè)NA單體都有一個(gè)!所以NA纖突具有4個(gè)催化中心& 3.3核蛋白(NP)NP是一種單體磷酸化的多肽!是構(gòu)成病毒核衣殼的主要成分&NP分子量約60 Ku!約有500個(gè)氨基酸! 具體特異性!是流感病毒診斷最具代表性的蛋白&倪建強(qiáng)等3[] 利用含組氨酸標(biāo)簽的pET30原核表達(dá)系統(tǒng)!表達(dá)純化出NP 蛋白作為診斷抗原!其特異性高&NP至少有3個(gè)互相重疊的抗原區(qū)!其中一個(gè)區(qū)在各株流感病毒間均存在!針對這一區(qū)的單克隆抗體可抑制病毒RNA的轉(zhuǎn)錄&??????(Polymerase)由PB1% PB2和PB3組成!其分子量分別為96 Ku%87 Ku和85 Ku3個(gè)聚合酶與NP蛋白和病毒RNA相連接!構(gòu)成病毒特異性的聚合酶蛋白復(fù)合體!具有轉(zhuǎn)錄和核酸內(nèi)切酶的活性&它們的氨基酸序列上都含有一特異的親核序列區(qū)!以便使這3種蛋白質(zhì)在胞漿合成后能順利進(jìn)入細(xì)胞核&PB1的功能是在病毒 mRNA合成開始后催化新合成的延伸反應(yīng)(PB2的功能是識(shí)別并切割宿主細(xì)胞的mRNA帽狀結(jié)構(gòu)以產(chǎn)生用于病毒RNA 轉(zhuǎn)錄的引物"PB3在病毒RNA合成過程中的作用尚不清楚! 可能是一種蛋白激酶或解旋蛋白M1和M2屬于非糖基化蛋白! 富含精氨酸!分別由252個(gè)和97個(gè)氨基酸組成"M1是維持病毒形態(tài)的結(jié)構(gòu)蛋白!具特異性!其抗原性的差異也是流感病毒分型依據(jù)之一"M2是一種跨膜蛋白!以四聚體形式存在于感染細(xì)胞的細(xì)胞膜上!起質(zhì)子通道作用!能使M1膜打開!病毒 RNP進(jìn)入胞漿"(Nonstructural Proteins!NS)!NSl與NS2相互間有70個(gè)氨基酸重疊!分別由不同的 mRNA翻譯"NSl在細(xì)胞核內(nèi)合成并積聚!NS2主要在胞漿中! 它們分別在早期感染和晚期感染存在"NS蛋白的N末端含一個(gè)典型的細(xì)胞核定位信號(hào)(NES)!被認(rèn)為在病毒vRNP向細(xì)胞核外轉(zhuǎn)運(yùn)的過程中發(fā)揮作用"Neumann等4[]!發(fā)現(xiàn)當(dāng)細(xì)胞感染了缺少NS2蛋白的病毒或病毒NS2位點(diǎn)發(fā)生改變時(shí)!vRNP 復(fù)合體滯留在細(xì)胞核內(nèi)不能向胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)" 4豬流感病毒的變異誘發(fā)豬流感病毒發(fā)生變異的主要機(jī)理有$%1&抗原漂移 (antigenic drift)$基因組自發(fā)的點(diǎn)突變引起小幅度的變異!積累到一定程度或正好使抗原決定簇發(fā)生改變"%2&抗原轉(zhuǎn)變 (genetic shift)$兩種不同亞型病毒感染同一宿主細(xì)胞!兩者的基因片段發(fā)生遺傳重組"%3&RNA重組(RNArecombination)"%4& 缺損性病毒顆粒的產(chǎn)生" 在單克隆抗體和自然免疫應(yīng)答的選擇壓力下!SlV各節(jié)段發(fā)生了不同程度的遺傳進(jìn)化"1930年分離的第一株豬流感病毒HA基因漂移發(fā)生率估計(jì)在每年0.4%!0.48%[5]"M1#M2基因的變異率相對較慢!M2基因變異較M1快!將 A/Sw/Quebec/5393/91與A/Sw/Quebec/192/81流感株比較發(fā)現(xiàn)!M1蛋白的變異率約為0.08"!M2蛋白的變異率約為 0.51%6[]"豬流感病毒H1N1的NP基因以每年3.41個(gè)核苷酸發(fā)生改變!對應(yīng)的是每年0.34個(gè)氨基酸發(fā)生改變7[]" 豬上皮細(xì)胞表面同時(shí)存在唾液酸-a-2!6半乳糖苷 (SAa-2!6-Gal)和SAa-2!3-Gal受體位點(diǎn)!因此豬能夠同時(shí)感染人流感病毒和禽流感病毒"當(dāng)2個(gè)或2個(gè)以上流感病毒同時(shí)感染一個(gè)豬體細(xì)胞時(shí)!在增殖過程中不同病毒的基因組片段可以隨機(jī)重新組合!產(chǎn)生新的流感病毒亞型8[]"Karasin等9[] 系統(tǒng)分析印地安那州H1N2亞型發(fā)現(xiàn)是由古典H1型和美國 1998年出現(xiàn)的H3N2基因重組的結(jié)果"Webby等[10]發(fā)現(xiàn)美國分離株H1N2是由H1N1的HA基因和H3N2的另外7個(gè)基因重組的結(jié)果"同時(shí)發(fā)現(xiàn)!不含HA基因的H1N2與H3N2的相似程度高于Karasin報(bào)道的H1N2!這也說明各個(gè)H1N2重組株有其獨(dú)立的重組過程"Marozin等1[1]比較歐洲的H1N1# H1N2和H3N2型SIV發(fā)現(xiàn)!各個(gè)基因型間發(fā)生了基因交換" 同時(shí)發(fā)現(xiàn)1999年法國分離豬源H3N2在抗原性上與 A/Sydney/5/19相關(guān)性很高!這揭示了豬與人的的病毒之間發(fā)生了抗原轉(zhuǎn)變" 國內(nèi)從山東豬分離出H9N2流感病毒!分析可能是由雞和鴨流感病毒重組的結(jié)果1[2]"繼H9N2亞型流感病毒1998年首次從豬群中分離到!李海燕等[13]部分序列分析發(fā)現(xiàn)豬源 H9N2亞型與國內(nèi)分離的禽流感病毒高度同源!從血清學(xué)和病毒學(xué)證明了H9N2亞型病毒在我國豬群中存在" 5豬流感病毒的疫苗研制當(dāng)前!豬流感病毒疫苗的使用主要還是滅活疫苗!隨著分子生物學(xué)的發(fā)展!促進(jìn)了基因工程和蛋白質(zhì)工程技術(shù)的建立! 運(yùn)用此類技術(shù)對疫苗進(jìn)行了多方面的研究" 豬流感病毒活載體疫苗是將表面抗原HA和#或NA基因克隆到病毒活載體上!表達(dá)融合蛋白用于免疫"HA蛋白因其良好的免疫原性使其成為基因工程疫苗的首選!HA誘導(dǎo)產(chǎn)生的體液免疫應(yīng)答和中和抗體所提供的有效保護(hù)力大于NA"Tang等1[4]將豬H3N2型流感 HA基因克隆進(jìn)腺病毒構(gòu)建重組體疫苗(rAd-HA)!接種小鼠后能夠部分保護(hù)人流感病毒A/HK/1/68(H3N2)的攻擊"Ronald等1[5] 構(gòu)建了表達(dá)豬H3N2型流感HA基因腺病毒重組體!將其接種三周齡仔豬!四周后!接種HA重組體的豬產(chǎn)生高水平的血凝抗體"在其它病毒載體的探索上!國內(nèi)成功地在桿狀病毒系統(tǒng)中表達(dá)了SIVA/Swine/HeNan/703/2001(H3N2)NA基因!Western $%&’和神經(jīng)氨酸酶活性檢測結(jié)果顯示!表達(dá)產(chǎn)物具有良好的免疫原性和神經(jīng)氨酸酶活性1[6]"同時(shí)H3亞型豬流感病毒HA基因重組偽狂犬病毒載體也獲得成功[17]" 近年來!國外學(xué)者嘗試將M2蛋白(M2e)作為免疫原研制疫苗"2002年!heinen等1[8]構(gòu)建了表達(dá)M2e的DNA疫苗!產(chǎn)生的抗體不能中和病毒!感染H1N1后!不能對豬提供保護(hù)力! 同時(shí)促進(jìn)豬出現(xiàn)嚴(yán)重的臨床癥狀"這與heinen等1[92]001年提出的M2e產(chǎn)生抗體的增強(qiáng)作用利于機(jī)體保護(hù)的觀點(diǎn)不一致" 豬感染病毒后!細(xì)胞膜表面表達(dá)M2e!接合M2的抗體通過細(xì)胞尋靶促進(jìn)感染細(xì)胞死亡!但由于產(chǎn)生抗體不具病毒中和能力!當(dāng)病毒感染量太高!就不能對機(jī)體提供有效保護(hù)"事實(shí)表明!將M2蛋白作為免疫抗原還需要進(jìn)一步探討" 與滅活疫苗相比!流感減毒活疫苗對流感能夠提供更持久的保護(hù)!同時(shí)!活疫苗能夠誘導(dǎo)局部和全身性的綜合性抗體以及CMI(細(xì)胞免疫)"近年來!反向遺傳學(xué)開始應(yīng)用于流感病毒的研制!反向遺傳操作技術(shù)是指通過構(gòu)建RNA病毒的感染性分子克隆!在病毒cDNA分子水平上對其進(jìn)行體外人工操作"該技術(shù)在人流感弱毒疫苗的開發(fā)獲得成功!1999年!Fodor等2[0]首次通過12質(zhì)粒系統(tǒng)拯救出流感病毒!其中8個(gè)含人源pol I啟動(dòng)子和丁型肝炎病毒核酶序列調(diào)控的轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒(transcription plasmid)分別克隆出8條流感vRNA!另4個(gè)表達(dá)質(zhì)粒pGT表達(dá)出PBl!PB2!PA和NP 蛋白’2000年Hoffman等[21]在此基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)!通過8個(gè)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染!成功地拯救出流感病毒!主要方法是構(gòu)建含有pol I-poi II雙啟動(dòng)子的質(zhì)粒載體!在pol I啟動(dòng)子與終止子間插入 pol II啟動(dòng)子0和多聚腺苷酸!再將病毒基因插入該系統(tǒng)!利用細(xì)胞酶系統(tǒng)拯救出流感病毒’也有報(bào)道構(gòu)建出流感病毒弱毒苗!其中HA和NA基因來自H5N1!其余基因來自H1N1" 質(zhì)粒系統(tǒng)拯救流感病毒的成功!表明可以在拯救株上引入多個(gè)變異位點(diǎn)!減弱毒株活性!研制出安生性更好的弱毒疫苗" 迄今為止!國內(nèi)外均沒有成功拯救出SIV的報(bào)道!但該技術(shù)對人流感病毒的成功拯救!表明反向遺傳技術(shù)是豬流感弱毒疫苗研制的方向"但是!反向遺傳技術(shù)研制弱毒苗仍然存在基因突變的可能性!因而在通向制備弱毒苗的道路上仍有很多問題亟待解決! 研究人員嘗試將NP蛋白作為流感基因工程疫苗的添加成份來加強(qiáng)免疫"Ronald等1[5]構(gòu)建的表達(dá)NP蛋白的腺病毒重組體能減少SIV的復(fù)制"同時(shí)促進(jìn)流感病毒的消除!heinen等[18]構(gòu)建表達(dá)M2#NP蛋白的疫苗能產(chǎn)生針對NP蛋白的淋巴組織增生"并且機(jī)體產(chǎn)生體液免疫的同時(shí)有細(xì)胞免疫!這可能由于NP蛋白上存在保守的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)表位和交叉保護(hù)抗原表位"能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生非特異性的細(xì)胞免疫!Larsen等2[2]把含有白介素6 (interleuki n-6)作為佐劑的HA DNA疫苗免疫豬"發(fā)現(xiàn)能夠刺激體液免疫的產(chǎn)生"但不能顯著地增強(qiáng)豬的免疫反應(yīng)! Haneberg等2[3]在流感病毒滅活疫苗中混入霍亂毒素或一種細(xì)菌微粒可促進(jìn)淋巴組織介導(dǎo)的免疫反應(yīng)"提高疫苗對機(jī)體的保護(hù)力!Hilgers等2[4]利用磺基脂多糖(SLP)構(gòu)成的SLP/S/W復(fù)合物作為佐劑和滅活流感疫苗共同免疫豬"能很好地刺激豬體產(chǎn)生體液免疫"其免疫效力強(qiáng)于單純的水包油乳劑! 6結(jié)語豬流感的暴發(fā)和流行"對養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的損失"同時(shí)" 因豬流感能夠感染人"其公共衛(wèi)生意義重大!對豬流感分子生物學(xué)#變異和免疫機(jī)制的進(jìn)一步研究"將為基因工程疫苗的研制及豬流感控制起到很好的作用! 參考文獻(xiàn): 基脂多糖(SLP)構(gòu)成的SLP/S/W復(fù)合物作為佐劑和滅活流感疫苗共同免疫豬"能很好地刺激豬體產(chǎn)生體液免疫"其免疫效力強(qiáng)于單純的水包油乳劑! 6結(jié)語豬流感的暴發(fā)和流行"對養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的損失"同時(shí)" 因豬流感能夠感染人"其公共衛(wèi)生意義重大!對豬流感分子生物學(xué)#變異和免疫機(jī)制的進(jìn)一步研究"將為基因工程疫苗的研制及豬流感控制起到很好的作用!